TEMES

"Bacillus" com a probiòtics

Els probiòtics

Els probiòtics són microorganismes vius que, en ingerir-los en quantitats adequades, poden tenir algun efecte positiu sobre la salut dels hostes (FAO/WHO 2006; World Gastroenterology Organisation 2011; Fontana et al., 2013). Els hostes poden ser els humans, però també altres animals. Els més utilitzats són els bacteris làctics —sobretot del gènere Lactobacillus— i els bifidobacteris, ambdós considerats com a GRAS per la FDA dels Estats Units d'Amèrica (Generally recognized as safe, 'generalment reconeguts com a segurs') o QPS per l'EFSA europea (Qualified presumption of safety, 'presumpció qualificada de seguretat').

Els probiòtics es consumeixen normalment des de fa mil·lennis, com passa amb una part dels aliments fermentats, i amb el iogurt i altres productes làctics. Actualment, s'afegeixen en alguns aliments i també poden ser administrats en medicaments o suplements dietètics, en forma de comprimits, càpsules o sobres, que contenen els microorganismes en forma liofilitzada, i són venuts sense recepta mèdica a les farmàcies (OTC en anglès, over-the-counter).

A banda dels bacteris làctics i els bifidobacteris, altres microorganismes que també s’utilitzen en certa mesura com a probiòtics són el llevat (Saccharomyces cerevisiae), algunes soques d’Escherichia coli, i alguns Bacillus, com ara veurem. També comencen a utilitzar-se alguns clostridials.

Els Bacillus

De fet, els Bacillus i els clostridials tenen en comú la capacitat de formar endòspores. Tots dos grups són grampositius, dins del fílum taxonòmic Firmicutes (Figura 1), que inclou també els bacteris làctics. Tanmateix, els bacil·lals (Bacillus i altres de semblants, però també estafilococs i Listeria) són evolutivament més a prop dels lactobacil·lals (els bacteris làctics) que dels clostridials. La principal diferència fisiològica entre Clostridium i Bacillus és que els primers són anaerobis estrictes i els Bacillus són aerobis o facultatius.

fig_1_tree_gram_ab.jpg

Figura 1. Esquema d'arbre filogenètic dels bacteris grampositius (Firmicutes i actinobacteris). Elaboració pròpia.

Les endòspores bacterianes (Figura 2) són les estructures biològiques més resistents, perquè sobreviuen als ambients inhòspits extrems, com radiacions UV i gamma, dessecació, lisozim, altes temperatures —són la referència per als càlculs d'esterilització tèrmica—, falta de nutrients i desinfectants químics. Es troben a terra i a l'aigua, on poden sobreviure durant períodes de temps molt llargs.

fig_2_bacillus_simon_cutting.gif

Figura 2. Endòspores (les parts blanques) de Bacillus subtilis en formació (Imatge de Simon Cutting).

Bacillus als aliments fermentats, sobretot asiàtics

Diversos Bacillus estan implicats clàssicament en els processos de fermentació d'aliments, sobretot per la seva capacitat de producció de proteases, amb la qual cosa durant les fermentacions contribueixen a l'enriquiment nutritiu amb els aminoàcids resultants de la proteòlisi enzimàtica.

Uns d'aquests aliments són els fideus de farina d'arròs fermentada, típics de Tailàndia i Birmània. S'ha vist que en aquesta fermentació intervé una varietat de microorganismes, amb bacteris làctics, llevats i altres fongs, però també amb bacteris aerobis entre els quals hi ha B. subtilis. S'ha trobat que l'activitat proteolítica d'aquests digereix i elimina substrats proteics de l'arròs que són al·lèrgens, com l'azocaseïna i, per tant, tenen una activitat beneficiosa per a la salut dels consumidors (Phromraksa et al., 2009).

Tanmateix, l'aliment fermentat amb Bacillus més conegut és la soja fermentada alcalina. Com sabeu, la soja (Glycine max) o faves de soja són un dels vegetals nutritius més consumits històricament, sobretot als països asiàtics. Se n'obté "llet" de soja, farina de soja, oli de soja, concentrat de soja, iogurt de soja, tofu (llet de soja quallada), i productes fermentats com la salsa de soja, el tempeh, el miso i altres. La majoria d'aquests fermentats es fan amb el fong Rhizopus, afavorint el seu creixement per acidificació o inoculant-lo directament. En canvi, si no s'acidifica i les faves de soja es deixen fermentar només amb aigua, els microbis naturals predominants que el fermenten són Bacillus, i d'aquesta manera s'obté, entre altres, el cheonggkukjang coreà, el kinema de la Índia, el thua nao del nord de Taïlàndia, el douchi xinès, el chine pepoke birmà, i el més conegut, el "natto" japonès (Figura 3). La fermentació espontània amb els Bacillus dona amoni com a subproducte, i per això és alcalina, la qual cosa confereix una olor no gaire bona a molts d'aquests productes, tot i que el natto, que s'elabora amb un cultiu seleccionat de B. subtilis, té un olor més suau i agradable (Chukeatirote, 2015).

Aquests aliments són bons des del punt de vista nutritiu, ja que contenen proteïnes, fibra, vitamines, i tot d'origen vegetal o microbià. A més, la publicitat del natto comercial emfatitza, a banda de dir que és elaborat artesanalment i es ven fresc (no congelat), les seves qualitats probiòtiques dient que els B. subtilis que conté promouen la salut gastrointestinal, immunològica, cardiovascular i dels ossos (www.nyrture.com). Diuen que el sabor i la textura del natto són exquisits. Es menja amb arròs o amb altres ingredients i salses, i també dins el maki sushi. Caldrà provar-lo!

fig_3_natto_pinterest-com_bacillus-subtilis-traditional-japanese-food.jpg

Figura 3. El "natto", faves de soja fermentades amb B. subtilis, és l'esmorzar amb arròs típic del Japó (Pinterest.com)

Bacillus com a probiòtic

Justament les endòspores són el principal avantatge dels Bacillus , que gràcies a la seva estabilitat tèrmica i a poder sobreviure a les condicions gàstriques (Cutting, 2011) poden ser utilitzats com a probiòtics. Si bé Clostridium també té aquest avantatge, la seva condició d'anaerobi estricte en fa més complexa la manipulació, a banda del "mal nom" d'aquest gènere degut a algunes conegudes espècies tòxiques d'aquest gènere.

A diferència d’altres probiòtics com Lactobacillus o Bifidobacterium, les endòspores de Bacillus poden ser emmagatzemades indefinidament sense aigua. Els productes comercials s’administren en dosis d’unes 10^9 espores per gram o per ml.

Cada cop hi ha més productes comercials de probiòtics que contenen Bacillus, tant per a consum humà (Taula 1) com per a ús veterinari (Taula 2). A més a més, també hi ha uns cinc productes específics per a aqüicultura amb diversos Bacillus, i sovint també les granges de gambes utilitzen els de consum humà (Cutting, 2011).

Per a ús en l'aqüicultura s'han obtingut productes probiòtics de barreges de Bacillus (B. thuringiensis, B. megaterium, B. polymixa, B. licheniformis i B. subtilis) aïllant-los de l'intestí de la gamba Penaeus monodon infectada de vibriosi. S'han seleccionat a partir de la biodegradació de nutrients i de la capacitat inhibitòria del patogen Vibrio harveyi (Vaseeharan & Ramasamy, 2003). Són preparats en liòfil o microencapsulats en alginat sòdic, i s'ha comprovat que milloren significativament el creixement i la supervivència de les gambes (Nimrat et al., 2012).

Com vèiem en els productes de consum humà, quasi la meitat de les marques (10 de 25) són elaborats al Vietnam. En aquest país l’ús de Bacillus com a probiòtic està més desenvolupat que en qualsevol altre, però els motius no són clars. Curiosament allà, com en altres països del sud-est asiàtic, no hi ha el concepte de suplements dietètics i els probiòtics com Bacillus només són venuts com a medicaments aprovats pel Ministeri de Salut. Es prescriuen per a la infecció per rotavirus (diarrea infantil) o l'estimulació immunològica enfront d'enverinaments, o són molt freqüentment utilitzats com a teràpia contra infeccions entèriques. Tanmateix, no és clar que se n’hagin fet proves clíniques tot i que són productes fàcils de comprar (Cutting, 2011).

Taula 1. Productes comercials de probiòtics amb Bacillus, per a consum humà (modificat de Cutting, 2011)
Producte País del fabricant Espècies de Bacillus
Bactisubtil ® França B. cereus
Bibactyl ® Vietnam B. subtilis
Bidisubtilis ® Vietnam B. cereus
Bio-Acimin ® Vietnam B. cereus i 2 altres
Biobaby ® Vietnam B. subtilis i 2 altres
Bio-Kult ® Regne Unit B. subtilis i 13 altres
Biosporin ® Ucraïna B. subtilis + B. licheniformis
Biosubtyl® Vietnam B. cereus
Biosubtyl DL® Vietnam B. subtilis i 1 altre
Biosubtyl I i II ® Vietnam B. pumilus
Biovicerin® Brasil B. cereus
Bispan® Corea del Sud B. polyfermenticus
Domuvar® Itàlia B. clausii
Enterogermina ® Itàlia B. clausii
Flora-Balance® Estats Units d'Amèrica B. laterosporus*
Ildong Biovita® Vietnam B. subtilis i 2 altres
Lactipan Plus® Itàlia B. subtilis *
Lactospore® Estats Units d'Amèrica B. coagulans*
Medilac-Vita® Xina B. subtilis
Nature's First Food® Estats Units d'Amèrica 42 soques, incloent-hi 4 B.
Neolactoflorene® Itàlia B. coagulans* i 2 altres
Pastylbio® Vietnam B. subtilis
Primal Defense® Estats Units d'Amèrica B. subtilis
Subtyl® Vietnam B. cereus
Sustenex ® Estats Units d'Amèrica B. coagulans

* Alguns etiquetats com Lactobacillus o altres bacteris porten realment Bacillus

Taula 2. Productes comercials de probiòtics amb Bacillus, per a ús veterinari (modificat de Cutting 2011)
Producte Animal País del fabricant Espècies de Bacillus
AlCare® Porcs Austràlia B. licheniformis
BioGrow® Pollastres, vedells, porcs Regne Unit B. licheniformis i B. subtilis
BioPlus 2B® Porcs, pollastres, dindis Dinamarca B. licheniformis i B. subtilis
Esporafeed Plus® Porcs Espanya B. cereus
Lactopure® Pollastres, vedells, porcs Índia B. coagulans*
Neoferm BS 10® Pollastres, vedells, porcs França B. clausii
Toyocerin® Vedells, pollastres, conills i porcs Japó B. cereus

Les espècies de Bacillus que veiem en aquestes taules són les que realment hi ha, un cop feta la identificació, ja que molts d’aquests productes estan mal etiquetats com a Bacillus subtilis o fins i tot com a Lactobacillus (Green et al., 1999; Hoa et al., 2000). Aquests errors en l’etiquetatge poden ser preocupants per al consumidor, sobretot per qüestions de seguretat, ja que alguns dels trobats són Bacillus cereus, que s’ha vist que pot ser causa d’infeccions gastrointestinals ja que força soques produeixen enterotoxines (Granum & Lund, 1997; Hong et al., 2005).

Els possibles Bacillus probiòtics han estat aïllats de diversos orígens. Per exemple, recentment s'han aïllat alguns B. subtilis de l'esmentat cheonggkukjang coreà, que tenen bones característiques de resistència a les condicions del tracte gastrointestinal (GI) i activitat antimicrobiana contra Listeria, Staphylococcus, Escherichia i fins i tot contra B. cereus (Lee et al., 2017).

Un d'aquests productes farmacèutics més coneguts és l'Enterogermina, amb espores de B. subtilis, que és recomanat per al tractament de desordres intestinals associats a alteracions de la microbiota (Mazza, 1994).

Bacillus al tracte gastrointestinal: hi són?, hi poden sobreviure?

S'ha discutit si les espores administrades poden germinar al tracte GI. Treballant amb ratolins, Casula & Cutting (2002) han utilitzat B. subtilis modificats amb un gen quimèric ftsH-lacZ, que s'expressa només en cèl·lules vegetatives, amb la qual cosa es poden detectar per RT-PCR fins a només 100 bacteris. D'aquesta manera han vist que les espores germinen en nombres significatius al jejú i a l'ili. O sigui, que les espores podrien colonitzar l'intestí prim, encara que transitòriament.

De manera similar, Duc et al. (2004) han conclòs que les espores de B. subtilis poden germinar al budell perquè després del tractament oral dels ratolins, se n'excreten més espores a la femta que les ingerides, senyal que han pogut proliferar. També han detectat, mitjançant RT-PCR, mRNA dels bacils vegetatius després de l'administració de les espores, i a més a més, s'ha observat que el ratolí genera resposta amb IgG contra cèl·lules vegetatives del bacteri. O sigui, que les espores no serien passavolants transitoris, sinó que germinarien passant a cèl·lules vegetatives, les quals tindrien una interacció activa amb les cèl·lules hoste o la microbiota, augmentant-ne l'efecte probiòtic.

Amb tot això, potser caldria considerar molts Bacillus no com a al·lòctons al tracte GI, sinó com a bacteris amb un cicle de vida bimodal de creixement i esporulació, tant al medi ambient com dins el tracte GI de molts animals (Hong et al., 2005).

Quant a la presència normal de Bacillus a l'intestí, quan s'estudien els diferents microorganismes habitants del tracte digestiu humà per a anàlisi metagenòmica del DNA de la microbiota, el gènere Bacillus no apareix. Els més habituals són Bacteroides i Clostridium, seguits de diversos enterobacteris i altres, inclosos els bifidobacteris (Xiao et al., 2015).

Malgrat això, s'han aïllat diverses espècies de Bacillus al tracte GI de pollastres, tractant mostres fecals amb calor i etanol per seleccionar només les espores, seguit d'incubació aeròbica (Barbosa et al., 2005). I més en concret, la presència de B. subtilis a la microbiota d'humans s'ha confirmat mitjançant aïllament selectiu en biòpsies d'ili i també de mostres fecals (Hong et al., 2009). Aquestes soques de B. subtilis presentaven gran diversitat i tenien capacitat de formar biofilms, esporular anaeròbiament i secretar antimicrobians, amb la qual cosa es confirma l'adaptació d'aquests bacteris a l'intestí, i per tant poden ser considerats comensals intestinals, i no solament bacteris del sòl.

Seguretat dels Bacillus probiòtics

El consum oral de quantitats importants de microorganismes viables que no són molt usuals al tracte GI posa sobre la taula dubtes addicionals sobre la seguretat. Això encara més en l'ús d'espècies que no tenen una història d'utilització segura en aliments, com és el cas dels bacteris esporulats. Fins i tot els habitants normals de l'intestí poden actuar a vegades com a patògens oportunistes (Sanders et al., 2003).

Amb l'excepció de B. anthracis i B. cereus, les diverses espècies de Bacillus generalment no es consideren patogèniques. Evidentment, les espores de Bacillus són consumides de forma usual sense adonar-se'n amb els aliments i en alguns fermentats. Encara que els Bacillus són reconeguts com a GRAS per a la producció d'enzims, fins ara la FDA no ha garantit l'estatus de GRAS per a cap esporulat amb aplicació com a probiòtic, ni Bacillus ni Clostridium. Mentre que Lactobacillus i Bifidobacterium han estat subjecte de nombroses i rigoroses proves de no toxicitat crònica i aguda, i un munt d'experts han revisat dades i han conclòs que són segurs com a probiòtics, no hi ha dades de toxicitat publicades sobre Bacillus en relació amb el seu ús com a probiòtic. En fer un repàs al Medline d'articles on surti el terme "probiotic" limitant-se a estudis clínics, de 123 referències no n'hi ha cap on surti Bacillus (Sanders et al., 2003).

En canvi, hi ha alguns estudis clínics on soques de Bacillus han estat detectades com a toxigèniques. Tot això explica que alguns productors de Bacillus probiòtics s'hi refereixen amb l’enganyós nom de Lactobacillus sporogenes, espècie inexistent, com es pot comprovar al NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy/?term=lactobacillus+sporogenes).

Finalment, cal recordar l'informe conjunt sobre probiòtics de la FAO (Organització de les Nacions Unides per a l'Alimentació i l'Agricultura) i l'OMS (Organització Mundial de la Salut) (FAO/WHO, 2006), que suggereix un conjunt de directrius per tal que un producte sigui utilitzat com a probiòtic, tant en forma única com en forma de nou suplement alimentari. Aquestes recomanacions són:

  1. Que el microorganisme estigui ben caracteritzat pel que fa a l'espècie, utilitzant mètodes fenotípics i genotípics (ex. 16S rRNA).
  2. Que la soca en qüestió estigui dipositada en alguna col·lecció de cultius reconeguda internacionalment.
  3. Avaluació de la soca in vitro per determinar-ne l'absència de factors de virulència: que no sigui citotòxica ni envaeixi cèl·lules epitelials, i que no produeixi enterotoxines o hemolisines o lecitinases.
  4. Determinació de la seva activitat antimicrobiana, i el perfil de resistència, incloent-hi l'absència de gens de resistència i la incapacitat per transferir factors de resistència.
  5. Avaluació preclínica de la seva seguretat en models animals.
  6. Confirmació en animals demostrant-ne l'eficàcia.
  7. Avaluació en humans (fase I) de la seva seguretat.
  8. Avaluació en humans (fase II) de la seva eficàcia (si fa l'efecte esperat) i eficiència (amb el mínim de recursos i el mínim temps).
  9. Etiquetatge correcte del producte, incloent-hi gènere i espècie, dosi precisa i condicions de conservació.
fao_logo.jpg who_logo.jpg

Conclusions

La utilització de Bacillus com a probiòtics, sobretot en forma de suplements dietètics, està augmentant molt ràpidament. Cada cop més estudis científics demostren els seus beneficis, com estimulació immune, activitats antimicrobianes i competència exclusiva. El seu principal avantatge és que poden ser produïts fàcilment i que el producte final, les espores, és molt estable, amb la qual cosa poden ser incorporats fàcilment al menjar quotidià. A més, hi ha estudis que suggereixen que aquests bacteris poden multiplicar-se al tracte GI i poden ser considerats com a residents temporals (Cutting, 2011).

D’altra banda, cal demanar un major rigor en la selecció i el control dels Bacillus utilitzats, ja que alguns, si no han estat ben identificats, podrien ser causa de trastorns intestinals. En qualsevol cas, donat que el nombre de productes venuts com a probiòtics que contenen els esporulats Bacillus està augmentant molt, cal no donar per descomptat que tots són segurs i cal avaluar cas per cas (Hong et al., 2005).

Bibliografia

Barbosa, T.M.; Serra, C.R.; La Ragione, R.M.; Woodward, M.J.; Henriques, A.O. (2005) Screening for Bacillus isolates in the broiler gastrointestinal tract. Appl Environ Microbiol 71, 968-978.

Bordons, A. (2017) Bacillus com a probiòtics. Blog "Bios i altres", 4 agost 2017.

Casula, G.; Cutting, S.M. (2002) Bacillus probiotics: Spore germination in the gastrointestinal tract. Appl Environ Microbiol 68, 2344-2352.

Chukeatirote, E. (2015) Thua nao: Thai fermented soybean. J Ethnic Foods 2, 115-118.

Cutting, S.M. (2011) Bacillus probiotics. Food Microbiol 28, 214-220.

Duc, L.H.; Hong, H.A.; Barbosa, T.M.; Henriques, A.O.; Cutting, S.M. (2004) Characterization of Bacillus probiotics available for human use. Appl Environ Microbiol 70, 2161-2171.

FAO/WHO (2006) Probiotics in food. Health and nutritional properties and guidelines for evaluation. Fao Food and Nutrition Paper 85. Reports of Joint FAO/WHO expert consultations.

Fontana, L.; Bermudez-Brito, M.; Plaza-Diaz, J.; Muñoz-Quezada, S.; Gil, A. (2013) Sources, isolation, characterization and evaluation of probiotics. Brit J Nutrition 109, S35-S50.

Granum, P. E.; Lund, T. (1997) Bacillus cereus and its food poisoning toxins. FEMS Microbiol. Lett. 157:223–228.

Green, D. H.; Wakeley, P. R.; Page, A.; Barnes, A.; Baccigalupi, L.; Ricca, E.; Cutting, S. M. (1999) Characterization of two Bacillus probiotics. Appl Environ Microbiol 65, 4288–4291.

Hoa, N. T.; Baccigalupi, L.; Huxham, A.; Smertenko, A.; Van, P. H.; Ammendola, S.; Ricca, E.; Cutting A. S. (2000) Characterization of Bacillus species used for oral bacteriotherapy and bacterioprophylaxis of gastrointestinal disorders. Appl Environ Microbiol 66, 5241–5247.

Hong, H.A.; Dic, L.H.; Cutting, S.M. (2005) The use of bacterial spore formers as probiotics. FEMS Microbiol Rev 29, 813-835.

Hong, H.A.; Khaneja, R.; Tam, N.M.K.; Cazzato, A.; Tan, S.; Urdaci, M.; Brisson, A.; Gasbarrini, A.; Barnes, I.; Cutting, S.M. (2009) Bacillus subtilis isolated from the human gastrointestinal tract. Res Microbiol 160, 134-143.

Lee, S.; Lee, J.; Jin, Y.I.; Jeong, J.C.; Hyuk, Y.H.; Lee, Y.; Jeong, Y.; Kim, M. (2017) Probiotic characteristics of Bacillus strains isolated from Korean traditional soy sauce. LWT - Food Sci Technol 79, 518-524.

Mazza, P. (1994) The use of Bacillus subtilis as an antidiarrhoeal microorganism. Boll Chim. Farm. 133, 3-18.

Nimrat, S.; Suksawat, S.; Boonthai, T.; Vuthiphandchai, V. (2012) Potential Bacillus probiotics enhance bacterial numbers, water quality and growth during early development of white shrimp (Litopenaeus vannamei). Veterinary Microbiol 159, 443-450.

Phromraksa, P.; Nagano, H.; Kanamaru, Y.; Izumi, H.; Yamada, C.; Khamboonruang, C. (2009) Characterization of Bacillus subtilis isolated from asoian fermented foods. Food Sci Technol Res 15, 659-666.

Sanders, M.E.; Morelli, L.; Tompkins, T.A. (2003) Sporeformers as human probiotics: Bacillus, Sporolactobacillus, and Brevibacillus. Compr Rev Food Sci Food Safety 2, 101-110.

Vaseeharan, B.; Ramasamy, P. (2003) Control of pathogenic Vibrio spp. by Bacillus subtilis BT23, a possible probiotic treatment for black tiger shrimp Penaeus monodon. Lett Appl Microbiol 36, 83–87.

World Gastroenterology Organisation Global Guidelines (2011) Probiotics and Prebiotics.

Xiao et al. (2015) A catalog of the mouse gut metagenome. Nature Biotechnol 33, 1103-1108.

cool_bacillus-subtilis-science-comics.jpg

NOTA

Article adaptat i modificat de l'original Bacillus com a probiòtics, publicat el 4 d'agost 2017 al blog "Bios i altres" d'Albert Bordons.

Contacta amb Divulcat